suizhemeizhijizaiyangzhiyezhongyingyongriyizengduo

，chanpinzhiliangyecanchabuqi
，shichangshangshiyoudiliemeizhijichuxian

，ermeizhijimeihuodecedingbijiaofansuo，youguanmeihuodedingyi


、測定方法、測定條件尚不統一
，給廣大用戶在選購和使用時造成很多不便，難免上當受騙造成不必要的經濟損失。本文就蛋白酶(中性蛋白酶和酸性蛋白酶)和澱粉酶活力簡便、快速測定方法簡介如下:

1蛋白酶活力的測定

1.1原理

采用福林-酚試劑法。福林-酚試劑在堿性條件下可被酚類化合物還原呈藍色(鉬藍和鎢藍混合物)
，由於蛋白質分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸

、色氨酸等)
，可使蛋白質及其水解產物呈上述反應。因此可利用此原理測定蛋白酶活力。通常以酪蛋白為底物，在一定pH值和溫度條件下，同酶液反應，經一段時間後終止酶促反應
，經離心或過濾除去酪蛋白籌沉澱物後取上清液，用Na2CO3堿化，再加入福林-酚試劑顯色
，藍色的深淺與濾液中生成產物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度計在660nm波長處測定，從而計算出蛋白酶的活力。

1.2試劑

1.2.l福林-酚試劑

向2000mL的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉(Na2WO4?2H2O)、25g鉬酸鈉及700mL的去離子水

，再加入50mL85%的磷酸及濃鹽酸l00mL，充分混合後，接上回流冷凝管，以文火回流10h
，結束後再加入150g的硫酸鋰(LiSO4)、50mL去離子水及數滴溴水

，再繼續沸騰15min

，以驅除過量的溴，冷卻後濾液呈黃綠色(如仍呈綠色，需再重複滴加溴水的步驟)，加去離子水定容至1000mL亂，過濾
，濾液置於棕色試劑瓶中，貯於冰箱中可長期保存備用。此溶液使用時可按1:3比例用去離子水稀釋。

1.2.20.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精確稱取TCA65.4g，加去離子水定容至1000mL。

1.2.30.4mo1/L碳酸鈉溶液精確稱取無水碳酸鈉42.4g，加去離於水溶解後
，定容至1000mL。

1.2.4pH值3～6醋酸緩衝液

精確取NaAc?3H2O16g與268mL濃度為6mol/L醋酸溶液混合，用去離子水稀釋定容至1000mL。

1.2.52%酪蛋白底物緩衝液

1.2.5.1測試酸性蛋白酶緩衝液

精確稱取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氫氧化鈉20mL(用去離子水配製)，在水浴中加熱溶解，然後用pH值3.6醋酸緩衝液定容至1000mL。當日配用或置於冰箱中保存。

1.2.5.2測試中性蛋白酶緩衝液精確稱取酪蛋白20g，置於1000mL三角瓶中,加入0.2mol/LNa2HPO4溶液(去離子水配製)610mL，在沸水浴中攪拌使其溶解，冷卻後過濾
，加入0.2mol/LNa2HPO4溶液(去離子水配製)390mL，用去離子水定容至1000mL，即成pH7.0
、2%酪蛋白溶液。當天配用或置於冰箱中保存。

1.2.6100μg/mL酪氨酸溶液

精確稱取100mg酪氨酸，逐步加入0.lmol/L鹽酸溶解後，用去離於水定容至100mL放入冰箱中保存，臨用時用去離子水稀釋10倍。

1.3操作步驟

1.3.1酪氨酸標準曲線的繪製

取18支試管分成6組(每組3支
，平行樣)，編號，按表1分別加入標準酪氨酸
、去離子水、0.4mol/L的碳酸鈉和福林-酚試劑，混勻後，放入40℃水浴保溫20min，然後在721型分光光度計上進行比色創定(波長66Onm)
，以濃度為Oμg/mL酪氨酸反位液做空白對照。

1.3.2樣品酶活的測定

精確稱取酶粉5g
，充分碾細,加去離子水100mL
，在40℃水浴中攪拌30min
，充分溶出酶蛋白
，然後過濾，留濾液待測。取4支試管編號(1號為空白對照)，分別加入酶液1mL,1號管立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL
，使酶失活，另3支樣品加入lmLpH7.0、濃度為2%酪蛋白底物緩衝液(如測酸性蛋白酶活力加pH3.6、2%酪蛋白底物緩衝液)，迅速混勻
，並立即放入40℃恒溫水浴準確計時，保溫1Omin後，立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL，終止反應
，同時向1號空白管中加入1mL2%酪蛋白底物緩衝液
，搖勻，繼續置於水浴中保溫2Omin
，取出離心或過濾除去剩餘酪蛋白及酶蛋白沉澱物，然後取各試管濾液1mL
，分別移入另4支試管中，再加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5nL和己稀釋的福林-酚試劑1mL，搖勻
，保溫顯色20min後，進行比色測定(波長66Onm)。對照標準曲線，計算酪氨酸含量。

管號標準酪氨酸去離子水Na2CO3福林一酚試劑酪氨酸含量

(100μg/mL)(mL)(mL)(0.4mol/L)(mL)(mL)(μg/mL)

101.0510

20.20.85120

30.40.65140

40.60.45160

50.80.25180

61.0051100

1.4蛋白酶活力計算

蛋白酶活力
，Ax4xN/l0。

式中:A:對照標準曲線得出的酪氨酸釋放量；4:4機反應液取出1mL
；N:酶粉的稀釋倍數；10:反應時間1Omin
；蛋白酶活性定義:在一定pH值(pH3.6或7.0)和40℃溫度條件下，每分鍾水解酪蛋白產生1μg酪氨酸定義為一個蛋白酶活力單位。

2澱粉酶活力的測定

測定澱粉酶活力的方法有4類，一是測定底物澱粉的消耗量
，有粘度法、濁度法和碘-澱粉比色法等；二為生糖法，測定產物葡萄糖的生成量；三為色原底物分解法，四是酶偶聯法。其中碘-澱粉比色法測澱粉酶活力操作簡便迅速

、實用。

2.1原理

碘-澱粉比色法澱粉經α-澱粉酶催化水解
，生成產物為葡萄糖、麥(mai)芽(ya)糖(tang)及(ji)糊(hu)精(jing)，在(zai)底(di)物(wu)澱(dian)粉(fen)濃(nong)度(du)已(yi)知(zhi)且(qie)過(guo)量(liang)的(de)條(tiao)件(jian)下(xia)，反(fan)應(ying)後(hou)加(jia)入(ru)碘(dian)液(ye)與(yu)末(mo)被(bei)催(cui)化(hua)水(shui)解(jie)的(de)澱(dian)粉(fen)結(jie)合(he)成(cheng)藍(lan)色(se)複(fu)合(he)物(wu)。其(qi)藍(lan)色(se)的(de)深(shen)淺(qian)與(yu)未(wei)經(jing)酶(mei)促(cu)反(fan)應(ying)的(de)空(kong)白(bai)管(guan)比(bi)較(jiao)成(cheng)比(bi)例(li)
，從(cong)而(er)計(ji)算(suan)出(chu)澱(dian)粉(fen)的(de)量(liang)
，推(tui)算(suan)肘(zhou)澱(dian)粉(fen)酶(mei)活(huo)力(li)。

2.2試劑

2.21底物緩衝液

精確稱，取9.0g；氯化鈉；22。6g無水磷酸二鈉和12.5g無水磷酸二氫鉀，置於約500mL去離子水中力口熱至沸騰溶解。稱取0.4g可溶性澱粉於一小燒杯中，加入10mL去離子水
，使其混懸後加人上述沸騰溶液中，冷卻至室溫後加入5mL37%甲醛溶液
，用去離子水稀釋至1000mL。此即為pH7.0、酶底物澱粉濃度為0.4g/L的緩衝液。

2.2.2碘貯存液(0.1mol/L)

稱取1.7835g碘酸鉀和22.5g碘化鉀，溶於去離子水中，再緩慢加人4.5mL濃鹽酸
，用去離子水稀釋至500mL，充分混勻
，貯棕色瓶中，每月配製新鮮溶液，置冰箱中保存。

2.2.3碘稀釋液(0.lmol/L)取碘貯備液用去離子水稀釋10倍，貯棕色瓶中，現用現配。

2.3操作步驟

稱取酶粉1.0g充分碾細
，加去離子水100mL,在40℃水中攪拌30min，充分溶出酶蛋白，過濾
，濾液備用。按表2分別加入底物緩衝液、酶濾液、碘稀釋液和去離子水，混勻，於660nm波長處(lcm光徑)，以去離子水調吸光度為零，讀各管吸光度。

表2試劑用量

加入物測定管（Ｕ）（３支平行樣）空白管（Ｂ）

底物緩衝液(40℃預溫５min,mL)1.01.0

酶濾液（mL）混勻，40℃水浴7.5min0.2-

碘稀釋液（mL）1.01.0

去離子水（mL）6.06.2

2.4澱粉酶活力計算

澱粉酶活力=式中:AB:空白管吸光度；AU:測試管吸光度
；澱粉酶活性定義:lmL酶濾液中(1g酶粉)的酶，在40℃和底物澱粉作用30min
，水解10mg澱粉為1個澱粉酶活性單位。

3討論

muqianshichangshangchushoudemeizhijizhongleihenduo
，youyumeidedingyihecedingfangfazhijinmeiyoutongyi，butongdeshengchanchangjiacaiyongbiaozhunhedingyiwangwanggebuxiangtong
，chanpinzhiliangshuomingyejiuqueshaokexueyiju。benwenjianjieledanbaimeihedianfenmeihuoxingdingyihecedingfangfa，gongtongxinggongtongtantao，yibianzhaochugengjiakexue、合理、統一的簡便易行的酶活測定方法

，促進酶製劑在飼料工業中的發展。

摘自：中國飼料添加劑網